1樓：
資訊比較少。 很難給你精準的答案。
根據你提供的資訊，試著分析。
連線之後，P不出來條帶，而且質粒提取跑膠結果不符合預期。如果，你的連線之後，驗證的PCR體系確實沒有問題，我推測，你在抗性板上挑的轉殖有誤。
你的抗性版是否加了藍白斑篩選，如果沒有加藍白斑篩選，只是挑了有抗性的轉殖，風險很大；需要進行藍白斑篩選。
2樓：
實名反對 @Yang Liu
1. 鹼抽提法的三個條帶中沒有線性化。我做過酶切實驗，線性化的條帶與質粒的三條條帶的位置都不一樣。三條帶裡面有線性化條帶是乙個一直以來的誤區。
2.T載除了藍白斑和抗性之外，不包含原核表達體系，不可能在E. coli中表達。
如果PCR失敗，那麼需要排除質粒濃度太高的問題，質粒的量太大了很容易PCR失敗。最好控制在1pg到10pg。
三個條帶的位置都比較奇怪，上個跑膠圖。
做個雙酶切實驗，看看能不能切出來2.3KB和T載的兩個條帶。
再有可能是第一步酶切的問題以及連線的問題，2.3kb需要和T載的比例控制在1:2-10。
當然還是很有可能是實驗設計問題。
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