未匯入的細菌,匯入普通質粒A,匯入重組質粒A的細菌如何區分?

時間 2021-05-30 03:57:30

1樓:易基因ZXM

1、質粒都會有乙個抗性基因,用這個抗性的平板去篩選就能得到轉入了該質粒的菌,沒有轉入質粒的菌就無法在抗性平板上生長

2、匯入普通質粒和A和重組質粒A(以B命名)的區分的話,就要看你的質粒A和B有什麼區別了,在A和B的特異性基因上設計引物,比如A質粒上的特異性引物是F1,R1,B的特異性引物是F2,R2;在你需要鑑定的平板上挑菌,1-10,挑單菌落液體培養,每個管子分別標記1-10,然後PCR。PCR的每個管子也要標記,挑的1號菌,每個菌用2對引物分別做PCR,用F1,R1能P出來預期條帶的就是含有A質粒菌,用F2,R2能P出來預期條帶的就是含有B質粒的菌。

2樓:芬蘭解放軍偵查兵

如果你手裡拿到的是菌液,重組質粒你有圖譜的話,塗個有抗板再做菌落pcr就行。

首先是上無菌操作台塗乙個有抗板,具體抗性取決於你的重組質粒,有些可能是雙抗。不過常見的也就是KAN,CM,AMP。如果第二天菌長出來太密你可以考慮稀釋一下菌液。

這步做完你已經篩掉了所有不含質粒的雜菌了。

第二步是菌落PCR/測序,把你第一步塗出來的板子上的菌挑出來,放到另乙個有抗板上做復刻。一般用移液槍槍頭點一下菌落,點一下復刻板,再去點一下配好的PCR體系。PCR配體系的時候你就當樣本量是0。

然後P出來跑個膠看一下長度跟你圖譜對不對得上。如果實在不放心建議送測序。如果確定是帶重組質粒了,你就可以把復刻板上的菌接出來準備保菌了。

3樓:Pigeons

樓上答得已經很完全了。有些情況下假如這個普通質粒是指空質粒(backbone,沒有插入基因但有抗生素抗性),重組質粒是指有插入基因的質粒的話。單靠抗生素或藍白斑是區分不出來的,需要過表達然後純化蛋白進行分辨。

具體要看你的質粒到底是啥,要是不知道是啥的話,就測個序吧

4樓:火鍋配冰闊落

質粒上一般都會帶有相應的標記基因,比如卡那黴素抗性基因或者氨苄黴素抗性基因。

只有匯入了載體的細菌才能表達抗性基因,才能在卡那或者氨苄的抗生素培養基上生長。因此用抗生素篩選平板曬出來的都是轉化子。轉化子裡面還有一些轉化了重組質粒的重組子,以及轉化了空載體的非重組子,比較常用的就是PCR方式進行檢測,用引物擴一下目的片段有沒有插入到載體上。

因為質粒具有不相容性,即相似的兩種質粒不能再乙個細胞內共存,因此得到的細菌都是只含有一種轉化載體的菌落,不會同時包含重組載體和空載。

還有一種比較方便的檢測重組子的方法就是藍白斑篩選,只有一些特定的載體和細菌中可以用。高中的話其實沒必要知道他的具體原理。簡單的說就是,這些載體上有乙個基因,在加了底物的培養基上,轉了空載的細菌會把底物降解產生藍色物質,使菌落呈現藍色。

而重組片段插入這些基因裡面,破壞掉這些基因,沒有辦法降解底物,菌落也就呈現白色。通過選擇白色菌落就可以得到重組子。不過後續還是要通過PCR確定是否是陽性重組子。

還有一些方法,比如讓空載體帶有致死基因,轉了空載體的細菌就沒有辦法生長;而將重組片段插入到致死基因裡破壞致死基因的重組載體,就不會導致細胞死亡,從而使獲得的單轉殖幾乎都是重組子。

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