1樓：
這題不難，至少看到答案之後學生肯定都能懂，所以說不難。至於原理，這裡就結合一下已有回答狠狠吐槽一波 PCR 來抒發一下最近做轉殖的怨念……
以下內容精簡版：別學生物
預設大家都知道 PCR 的基本原理。第一小題沒有什麼問題，這是個經典的突變引物 PCR 方法。
但是第二小題，正如 @吳思涵 所說：「理想很美滿現實很骨感」。其實題主的說法也不對，這並不是融合 PCR。
按照題目的方法去嘗試連線不是 「會出來很多奇怪的東西」，而是很可能什麼都 P 不出來……建立在 PCR 技術上的分子轉殖技術現在已經發展得很成熟很傻瓜了，可以說唯一的技術門檻是引物設計。然而這些技術在業內依然被認為是 「玄學」 一樣的存在……引物設計在這個 「玄學」 裡還是佔相當大比重的。
先說融合 PCR。顧名思義，融合 PCR 是要將兩段 DNA 片段通過 PCR 延伸的方法接在一起。我們一般是這樣做的（雙元件方便理解，三片段改一下末端引物是一樣的）：
1：使用突變引物在元件序列末端引入重疊序列（overlap）
2：混合帶 overlap 的元件序列，用兩側引物擴增
3：獲得組裝產物
為什麼不能直接將帶 overlap 的元件混合，將 5'-3' 方向的鏈作為長引物來延伸，而要加入額外的末端引物呢？由於加入體系的元件是雙鏈形式，體系中存在等摩爾量的與長引物配對的反向鏈，在退火階段，這條配對長度非常大的反向鏈會展現出強大的結合能力，迅速地與長引物結合從而造成遮蔽效應，導致延伸效率低下。這也就是絕大多數 PCR 體系都要求引物過量的原因——通過提高濃度彌補結合能上的不足，以此在與反向模板鏈的動力學競爭中取得優勢。
加入額外的末端引物之後，實際上是在同乙個體系中製造了（擴增產物為 5『-3』 端長引物的）兩個不對稱 PCR 體系，線性地增加長引物的量，從而使長引物之間有機會避開反向鏈的遮蔽，得以結合延伸產生組裝產物。一旦體系中產生了組裝產物，這個 PCR 體系就可以被視為乙個指數擴增的（以末端引物擴增組裝產物的）經典 PCR 系統了。這也就是 @Pat 說的 OE-PCR。
1：使用突變引物在元件片段上引入 overlap
2：OE-PCR 體系中的擴增長引物的兩個不對稱 PCR 體系
3：未被反向鏈遮蔽的長引物退火結合，延伸產生組裝產物
4：通過末端產物擴增組裝產物的經典 PCR 體系
5：獲得組裝產物
題目當中寫道 「大量的N 基因片段」，應該是想表達 「過量」 的意思，作者的想法是：在退火階段，通過過量的 N 片段與 A1、A3 片段的反向鏈競爭，從而使 A1 片段的正向鏈和 A3 片段的反向鏈能夠與 N 片段結合從而延伸。假如這種讓模板過量的神奇想法能夠 work，極限情況下也只能拿到加入的 A1 或 A3 片段（摩爾）濃度的組裝產物。
但實際上這玩意兒拿去跑膠分離的話，主帶妥妥是過量的 N 片段，而且麻煩之處在於，電泳區分度越大要求 A1 和 A3 片段越長，而 A1 和 A3 片段越長擴增效率就越低……
「擴增產物」 的話，（特異性足夠好的情況下）當然只能是 A1-N、N-A3 和 A1-N-A3 片段。前二者的退火階段是二級反應，後者則是二聯的二級反應，因此從熱力學角度看這裡所謂的 「絕大多數擴增產物」 並不是出題人想象的 A1-N-A3 片段，而是 A1-N 或 N-A3 片段。
@吳思涵 在專欄裡介紹的 Gibson 方法是乙個超超超好用的技術（這技術不算在 PCR 技術大類下面的話給個諾獎真的是當得起啊），TA 轉殖什麼的大家都不是很樂意用了。專欄文章裡說一般 overlap 長度 >15bp，但大家做的時候更多地會選擇 21~25bp 的 overlap 求穩。不過我有過一次設計引物失誤，當時的 overlap只有 8bp，也成功地 gi 上了……片段數量方面，雖然嘴上說 10 個片段都沒問題，但熱力學規律擺在那裡，一般大家體系裡不會放 4 個以上的片段，實在需要多片段組裝可以先把序列拼出來搭到質粒上用以擴增，再用分部組裝的方法整合起來——如果 10 片段效率真的很不錯的話，雙片段做環化的時候怎麼不見轉化子裡有大量的重複錯誤（-A-B- 拼出來 -A-B-A-B- 這樣）？
第三題就比較看不懂了。首先我沒太弄明白把插入 N 基因的 A 基因轉入耐藥的四膜蟲當中是要幹什麼……敲入難道不是應該用無耐藥性的做靶細胞嗎？如果你的假設是 「A 是耐藥基因」，那麼往乙個耐藥四膜蟲裡轉乙個冗餘的缺陷掉的 A 基因，用藥篩確定敲入之後這貨也不會丟失抗藥性啊……
話說回來，把乙個基因插入到另乙個基因的可讀框裡面，還想讓它 work，這是一件很蛋疼的事情……這中間有一萬種辦法讓你表達不出來抗藥性：
插錯位置移碼突變，卒；
插到內含子中間剪接突變，卒；
啟動子不對導致表達產物數量不夠，卒；
兩端的冗餘多肽干擾氨基糖苷磷酸轉移酶活性，卒；
靶基因有膜定位導致插入蛋白摺疊被膜拓撲結構卡住，卒……
（不要問我為什麼知道這些……）
而生物系統最令人抓狂的是，這邊你想方設法讓插入基因表達可能都搞不定，反過來靶基因中間插了這麼一段，保不齊活性也沒有丟失……
第乙個空肯定應該填 「巴龍黴素」（當然作死的話也可以填 「新黴素」、「卡那黴素」、「慶大黴素」 以及 「G418」 裝逼），第二個空出題人可能想說 「失活」，但真正穩妥的可能是 「內部插入 N 基因」，畢竟插乙個片段進去真不一定就能讓這個基因失活……
總結：標答：A1-N-A3 融合片段；巴龍黴素；缺陷/失活（難度：一般）
真實的故事：A1-N 和 N-A3 融合片段； 氨基糖甙類抗生素；內部插入 N 基因（難度：呵呵噠）
2樓：
剛好一模就是這套題
實際難點在於做到這裡心裡發慌，因為時間很短。問題應該在於理綜時間分配問題。本身不難吧。
我沒做出來就是因為做到這裡發慌於是錯了。所以生物無論如何30min做題時間不能少！可能做不出來的是敲除那個空。
自己沒事再畫畫圖啥的應該能解決.
3樓：Pat
本來只是回覆在乙個回答下面。又稍微看了一點東西之後覺得還是值得整理回答一下。
首先說，我對高中生學生物的態度是目的還是為了考試，別跟老師較真，自己明白就完了。
關於PCR的部分，這個方法的問題在於相當於用長雙鏈DNA變性後期待變成引物，退火後結合模板，然而雙鏈DNA自結合的可能性更大吧。一般這樣構建敲除載體要麼按類似圖示方法擴增後用酶把那三段連起來，要麼用合成長引物帶入同源臂。前者允許的同源臂更長，後者由於成本限制只能達到70bp左右。
當然也和物種的重組效率有關。用「雙鏈DNA」做引物的辦法也不是沒有，upstate以前出過乙個試劑盒就是用互補引物，實際也就是雙鏈DNA了，來做點突變，但效率實在不高，因為引物利用率的問題，比起尾對尾的引物效果差很多，但可以做。之所以這裡行不通是因為作為引物的部分本身比雙鏈間自己互補的長度還要短，因此無法期待退火後有效的結合模板，而不是自結合。
但事實上，有一種辦法能讓這個擴增完成，叫做overlap extension PCR。說起來也簡單，就把三段模板加進去，然後再加入I和IV的引物就行了。
最後說，四膜蟲的生殖模式實際比這裡敘述的複雜得多，本身有分大核小核，配子生殖的過程也很複雜。這裡的圖是很有誤導性的。所以也給生物老師們乙個建議：
請明白有很多你們自己都沒搞懂的知識，然後不要用這些你們自己搞不懂的東西來糊弄孩子們！
給感興趣的自己參考吧
Genetics
4樓：大辣子雞
沒錯，對於高中生來說算是難題了，但是只要掌握了書上對pcr的講解，只要孩子動動腦筋，實在不行就動手畫一下前幾輪的模擬圖，答案也就很明確了。但是這個第二問看起來真的挺奇怪 （(￣◇￣;)反正至少我們做實驗絕對不會這麼搞。
難點不在於知識本身，而是在於很可能學生看到了乙個自己從沒見過的知識，就把學生嚇懵了，從而使知識遷移能力沒有很好的發揮。
最後還是要強調，高中生物課本上的一定要掌握，掌握了基礎，什麼么蛾子來基本都是不用太虛的。
5樓：
在高中算難題但是不算過分。主要是出題老師想得不周全，很多問題學生會想到老師卻沒圓好。
第一題D不用說
第二題出題者表述得太不清晰，這什麼鬼玩意……接成一條A2換成抗性基因的概率估計十分感人。不說明白A1A3帶不帶xy，不說明抗性基因上的xy是左圖中引物的一節。
我猜了半天……結論是如果倆引物一樣的話會粘成乙個這玩意：
傳不上去圖，簡單來說就是乙個方形DNA，四個角都有著觸角。
（不要笑！）
第三個靠最後一句話可以整個逆推出來，留點心還能逆推出第二題來。
6樓：心有戚戚焉
其實重點是，這就是乙個用陌生詞和高階技術(對於大多是沒聽過pcr的學生來說)包裝出來的普通高中生物題，簡單技巧填空(相比於無腦填空)。
精煉一下提幹，答案都顯而易見。出題人的目的並不是讓這群高中生了解pcr或者四膜蟲，而且用這道題拉開學生之間的分差啊。
看問題不能看表面啊。
說不定哪天老師還能把流式細胞編個壓軸題拉分差呢。或者把crispr編個壓軸題也有可能。然而流式細胞和crispr即使跳了生物坑他們也不一定接觸的到。
7樓：
反覆看了好幾遍發現的確只用到高中知識就可以解決了
而且居然還考慮到了homology arm 除了構建方法有點奇葩之外都沒什麼問題
A1 A3如果太長恐怕效率應該很低
8樓：
坦白來講，如果是高三的話，這題只能算是一般難度…（來自一普通高考弱省的嘲諷）
高中生物嘛，反正課本上都是對的，只要不偏離課本的基本原理設計出來的方案都是可行的，考試它又不能超綱，所以你問的問題在書上絕對都是可以找到原文支撐的，可以多去翻翻選修3-3，還有前面講到dna轉錄翻譯的部分。
9樓：洛明
看了這道題之後感覺回到了過去。
想起了同桌的她在做生物題認真的樣子。
那一年我們在江蘇。
那一年我和她選修物理生物。
那一年我們的生物題都長這樣。
記得高考前，去拜訪南農大的乙個表叔（生物方向的乙個教授），當我問詢這幾年江蘇生物的考試題型。他很直白的告訴我有些內容大學裡才學。這是為我們以後進入大學打好基礎。
那一年選專業，我沒有選擇生物工程。
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