如何通俗地理解 2014 年諾貝爾化學獎 超分辨螢光顯微技術 的技術原理及其帶來的改變?

時間 2021-05-11 00:17:03

1樓:流影隨光

光學懂的不多,只知道他們利用自己的奇思妙想突破了可見光的衍射極限,對於細胞生物學的意義卻是顯而易見的,實際上我們對於細胞器乃至一些重要單分子在細胞中的功能所知甚少,以往衍射極限的存在使得我們無法觀察到這些分子的位置及運動情況,對細胞的探索更像是盲人摸象,電子顯微鏡等技術雖然解析度極高,卻無法滿足活細胞觀察的巨大需求,然而sted以及palm等技術的出現為之提供了可能,假以時日這種手段如果能應用於活細胞成像平台,那麼對於分子細胞生物學的研究者來說就像有了近視鏡的高度近視患者一樣,研究細胞器乃至功能分子的過程會簡單許多

2樓:SeekU

之前的顯微鏡技術,最好的解析度在光波長一半左右。用了STED,需要兩種不同波長的光並且需要調製其中乙個。但是解析度可以到波長的二十五分之一。改進還是很明顯的。

3樓:

瀉藥,慢慢填坑ing。補充其餘的幾個答案。

「衍射極限」,由於光的波動性,普通光學儀器的解析度受限與工作波長和數值孔徑,其解析度大約在為光的波長量級。聚焦光斑點點擴散函式(PSF)描述了系統的解析度。

「螢光」是光致發光效應的一種,在電子受激進入不同的電子單重態S2後,通過無輻射的系內轉換等進入能量稍低的第一激發單重態S1中,再通過振動弛豫的方式到達S1中能量最低的振動能級上,然後回到基態的振動能級中並發射出光子。如下圖Jablonski 能圖所示

普通的螢光顯微技術,採用螢光染料對特定的組織細胞進行染色,或者使用特定的螢光蛋白,通常採用汞燈激發螢光,相比與普通的光學顯微鏡大大提高了影象對比度。但也面臨著存在螢光漂白,缺乏深度資訊等。改進後的有雷射共聚焦掃瞄(Confocal)、多光子螢光掃瞄顯微鏡(Muti-photon)等,大大提高了解析度或成像深度,不過依然受到光學衍射極限的限制。

電子顯微鏡可以突破衍射極限,但是不適合對生物樣品成像,更不可能活體成像;一些近場顯微的方法也能突破衍射極限,但是掃瞄速度通常很慢,而且只能對樣品的表面資訊成像,無法探測深度資訊。目前在遠場突破衍射極限的光學顯微方法大約可以兩大類:

改變激發光的點擴散函式,比如STED, SIM

單分子成像技術,比如PALM, STORM

受激發射損耗顯微技術(STimulatedEmissionDepletion,STED)

摘自樓下某老師的主頁

超分辨光學顯微實驗室(Superresolution Optical Microscopy Lab)

ZEISS Microscopy Online Campus

激發射損耗顯微鏡(STED)其基本原理如下圖所示, 紫色代表的是激發雷射,綠色代表的是用來受激發射損耗的雷射,兩束雷射經過時間空間調製後同時照射在樣本上。激發光使螢光物質發光的同時,STED雷射發射一束緊挨著的、環型的、波長較長的雷射將激發光斑中大部分的螢光物質通過光學非線性作用被強行回到基態抑制其發螢光,從而減少螢光發射光斑面積。激發光光斑經STED雷射的調製後大大的減少了發射螢光分子的光斑大小,並且隨著STED雷射光強的增加,能發射螢光光斑越小,其半高全寬可以達到衍射極限以下,解析度不再受光的衍射所限制,從而打破衍射極限。

通過三維掃瞄可以得到50nm以下的三維影象。

目前世界領先(就是這次獲獎的Hell小組)的解析度已經在幾個奈米級別了。國內的話,師從Hell的北大席鵬小組大約在60nm(2023年);浙大的劉旭、匡翠芳小組的G-STED系統約為38nm(2023年)。

基於STED的原理,又有相似的幾種方法被發明出來:

激發態吸收(ExcitedStateAbsorption,ESA)

ESA是將已經在激發態中的電子,通過環形的激發光繼續激發使其到達更高的能級單重態中,於是也就將中心點的螢光區分開來了,達到了降低點擴散函式的目的。

基態清空(GroundStateDepletion,GSD)

GSD是剛開始就把周圍的粒子通過乙個強激發使他們獲得很高的能量,讓他們慢慢自己回到乙個不發光的三重態,這時候能夠被激發的就只有中心的粒子,也就自然而然地減小了點擴充套件函式。

STED/ESA/GSD/等技術被Hell統稱為RESOLFT(reversible saturable/switchable optical transitions) 可逆飽和/開關光躍遷

目前,STED技術已經被德國Leica公司買去成功商業化,商業系統的解析度在80nm以下。Leica TCS SP8 STED 3X

以下待填坑

結構照明顯微技術(StructureIlluminationMicroscopy,SIM)

光啟用定位顯微技術(PhotoActivatedLocalizationMicroscopy,PALM)

隨機光學重構顯微技術 (STochasticOpticalReconstructionMicroscopy,STORM)

4樓:yinan zhang

參見哈佛大學庄小薇實驗室的工作,Zhuang Home。通俗的一句,各類超分辨螢光顯微技術的實質並非超越了abbe原理,而是在一定時間範圍內(幾飛秒-幾微秒)連續多次激發的螢光然後用電腦進行變換解析後,得到的一種概率清晰度。大概表達為用時間換解析度吧。

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