1樓：雨花
最好別用poly A，特異性很成問題。夠土豪的話上TaqMan，品質保證，不夠的話設計頸環引物，RT引物配對miRNA末尾6-8個nt連著hairpin字尾，序列無所謂，只要形成hairpin就行。PCR引物配對miRNA從第乙個鹼基開始算18-20個位置取決於melting temp.
再設計乙個PCR用3'引物,跟你前面的hairpin結構中的一段互補。
跟關於mirRNA反轉錄的技術問題？ - 吳思涵的回答 說的一樣。
例如:miR-16: UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG
RT primer: CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA(劃線部分與miR-16最後8個nt互補，非劃線部分叫作adapter，可以自選，只要形成乙個hairpin)
Forward primer: ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA (劃線部分與miR-16序列互補，前面加了overhang。為什麼要加overhang是因為melting temp不夠。
overhang序列一般可以對所有miRNA通用)
Universal reverse primer (URP): TGGTGTCGTGGAGTCG (與adapter的中間一段配對。所有miRNA通用，序列依賴於adapter序列)
總之，依葫蘆畫瓢，Ctrl+C, Ctrl+V就行了。adapter各個實驗室經常不一樣，可以自選，只要形成乙個hairpin就行。
實際操作的時候用RT primer取代逆轉中的random hexmer或者oligo-dT。然後RT產物用Forward primer+URP加上SYBR Green Master Mix跑PCR。TaqMan的原理和這個基本相同，區別在於TaqMan不用SYBR Green而是使用MGB探針。
特異性TaqMan大約是3'端2個nt，SYBR大約要3個nt才能充分區分
2樓：村口王師傅
。。。。被吸引進來是因為標題多打了乙個r。。。話說，一般，miRNA反轉是用莖環引物的，樓上有文獻。設計好引物加個kit非常非常簡單。題主不必擔心
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